Castellio wurde damit zu einem der Väter des Toleranzgedankens im 16. Jahrhundert. Seine Haltung ist in einer Skepsis begründet, die er in seiner erst nach seinem Tode veröffentlichten Schrift De Arte Dubitandi entwickelt. Aus seiner Sicht gibt es Fragen des Glaubens, über die nicht mit dogmatischem Wahrheitsanspruch entschieden werden kann. Für diese Fällen gilt es, die Kunst des Zweifelns auszubilden. Der Glaube, zu dem er sich bekannte, muss in vielen Fragen auf allgemeingültige Bestimmtheit verzichten und stützt sich stattdessen auf die Reflexion im Medium des Bibeltextes und die Auseinandersetzung mit der Unterbestimmtheit von dessen Übersetzung. Seine Schriften wurden verboten, aber in ganz Europa nachgedruckt und verbreitet. Toleranzdenker von Locke und Bayle bis Lessing hielten seine Überlegungen und seinen Mut in Ehren. Im Frankreich des späten 19. Jahrhunderts wurde die Lektüre seiner Schriften wegweisend für die Konzeption eines laizistischen Staates, der mit der Trennung von Kirche und Staat die Rechte religiöser Minderheiten zu stärken versprach. Im Zwanzigsten Jahrhundert setzte Stefan Zweig mit dem Roman Castellio gegen Calvin oder Ein Gewissen gegen die Gewalt (1936) Castellio ein Denkmal, das bis heute die Leser und Leserinnen in seinen Bann zieht.