Castellio divenne così uno dei padri della dottrina della tolleranza nel XVI secolo. Il suo pensiero è radicato in uno scetticismo che trovò piena formulazione nel De Arte Dubitandi, testo pubblicato solo dopo la sua morte. Agli occhi di Castellio vi sono questioni inerenti alla fede su cui non è possibile prendere delle decisioni basandosi su pretese dogmatiche di verità, ma è invece necessario esercitare l'arte del dubbio. Di fronte a molte domande, la fede che Castellio professa deve rinunciare a definizioni universalmente valide e appoggiare piuttosto su una riflessione costantemente mediata nella Bibbia e che si confronta però anche con l'indeterminatezza della traduzione dello stesso testo sacro. Gli scritti di Castellio, seppur vietati, furono comunque ristampati e diffusi in tutta Europa. Teorici della tolleranza come Locke e Bayle fino a Lessing ammirarono le sue idee come pure il suo coraggio. Nella Francia di fine Ottocento, la lettura dei suoi scritti svolse un ruolo fondamentale nella concezione di uno stato laico, che tramite la separazione di Stato e Chiesa prometteva di consolidare i diritti delle minoranze religiose. Nel XX secolo, il romanzo di Stefan Zweig Castellio gegen Calvin oder Ein Gewissen gegen die Gewalt (1936) consacrò definitivamente alla memoria collttiva Castellio, che ancora oggi continua ad affascinare lettori e lettrici.